Efectos de 5G - Relé Co., Ltd.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8305 (2023) Citar este artículo

422 Accesos

7 Altmetric

Detalles de métricas

Los riesgos potenciales para la salud de la exposición a los campos electromagnéticos de radiofrecuencia de las tecnologías de comunicaciones móviles han generado preocupación social. Se han establecido directrices para proteger a la población (p. ej., calentamiento no específico por encima de 1 °C bajo exposición a campos de radiofrecuencia), pero quedan dudas sobre los posibles efectos biológicos de las exposiciones no térmicas. Con la llegada de la quinta generación (5G) de comunicaciones móviles, evaluar si la exposición a esta nueva señal induce una respuesta de estrés celular es uno de los pasos obligatorios en la hoja de ruta para una implementación segura y una evaluación del riesgo para la salud. Utilizando la técnica BRET (Bioluminescence Resonance Energy-Transfer), evaluamos la exposición continua o intermitente (5 min ON/ 10 min OFF) de queratinocitos humanos vivos y células de fibroblastos a señales 5G de 3,5 GHz a una tasa de absorción específica (SAR) de hasta 4 W/kg durante 24 h impactan la actividad basal o inducida químicamente del factor de choque térmico (HSF), el virus del sarcoma RAt (RAS) y las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK), y la proteína de la leucemia promielocítica (PML), que son moleculares. vías implicadas en las respuestas ambientales de estrés celular. Los principales resultados son (i), una disminución de la señal BRET basal de HSF1 cuando las células de fibroblastos se expusieron a los SAR más bajos probados (0,25 y 1 W/kg), pero no al más alto (4 W/kg), y ( ii) una ligera disminución de la eficacia máxima de As2O3 para desencadenar la SUMOilación de PML cuando las células de fibroblastos, pero no los queratinocitos, se expusieron continuamente a la señal 5G RF-EMF. Sin embargo, dada la inconsistencia de estos efectos en términos de tipo de célula afectada, SAR efectivo, modo de exposición y respuesta de estrés celular molecular, concluimos que nuestro estudio no muestra evidencia concluyente de que pueden surgir efectos moleculares cuando las células de la piel se exponen a la RF 5G. -EMF solo o con un estresor químico.

Dentro del rápido despliegue de las telecomunicaciones móviles en las últimas décadas, la quinta generación (5G) de redes inalámbricas fue diseñada para mejorar la tecnología 4G LTE resolviendo problemas relacionados con el aumento exponencial del uso, la cantidad de dispositivos conectados y la necesidad de mayor confiabilidad y menor latencia1,2. Tales logros requerían nuevas bandas de frecuencia además de las ya implementadas para 2G, 3G y 4G. Entre ellos, la banda de 3,4 a 3,8 GHz ofrece un buen compromiso entre cobertura de banda ancha y velocidad, mientras que la banda de 26 GHz, caracterizada por una propagación y penetración deficientes dentro de los edificios, se implementará en una segunda etapa para cubrir áreas limitadas con una gran cantidad de datos. tráfico. Por lo tanto, la banda de 3,5 GHz (también conocida como banda C), que puede usar los mismos sitios celulares que las antenas móviles actuales de 2,6 GHz y 1,8 GHz, es la banda central del 5G actual.

Los efectos biológicos y para la salud de la exposición a campos electromagnéticos de radiofrecuencia ambientales (RF-EMF) han sido objeto de numerosos estudios desde finales del siglo XX y siguen siendo el centro de las preocupaciones de la sociedad. Este campo de investigación también se vio fortalecido por la decisión de la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) en mayo de 2011 de clasificar los CEM de RF como carcinógenos 2B.

En particular, si bien la energía de los fotones de RF no es lo suficientemente fuerte como para desencadenar modificaciones químicas en objetivos biológicos, como roturas de ADN, el calentamiento dieléctrico del tejido vivo bajo la exposición de RF-EMF está completamente caracterizado. Por ello, se establecieron pautas para proteger a la población frente a los riesgos asociados3. Sin embargo, si la exposición a RF-EMF puede desencadenar efectos "no térmicos" (es decir, efectos biológicos no causados por la elevación de la temperatura en el tejido vivo) sigue siendo un tema difícil de estudiar. Dado que no existe un soporte mecánico para estos efectos, la comunidad científica solo puede confiar en la investigación empírica sobre los posibles efectos no térmicos de RF-EMF4,5,6.

Desafortunadamente, hay muy pocos datos disponibles de estudios científicos sobre el peligro biológico potencial que presenta la exposición de RF-EMF a las nuevas señales de frecuencia utilizadas en 5G. Hasta donde sabemos, solo se han publicado seis artículos, realizados por cuatro equipos diferentes, que exploraron los efectos de la RF-EMF de 3,5 GHz no modulada o modulada por GSM en la materia viva, pero desde entonces no se han publicado estudios biológicos con 5G. -señales RF-EMF de 3,5 GHz moduladas. Dasgupta et al. expuso al pez cebra en desarrollo a RF-EMF de 3,5 GHz no modulado a una tasa de absorción específica (SAR) de 8,27 W/kg durante 6 a 48 h después de la fertilización en condiciones de cultivo isotérmicas7,8. Estos autores midieron efectos sensoriomotores sutiles pero persistentes y una interrupción transcriptómica modesta a las 48 h después de la fertilización, con 28 genes expresados diferencialmente en los grupos expuestos. Queda por determinar si estos efectos aún se pueden medir usando niveles de SAR que cumplan con las pautas. Wang et al. evaluó el impacto de las exposiciones a corto y largo plazo utilizando RF-EMF de 3,5 GHz no modulado en tres SAR diferentes (2,6, 26 y 260 mW/kg) en Drosophila melanogaster9,10. Estos autores mostraron un impacto moderado pero significativo en la actividad, el sueño y el desarrollo de los insectos que estuvo acompañado de una modificación en la expresión de genes implicados en los ritmos circadianos, el estrés térmico, el estrés oxidativo y la inmunidad humoral. Yang et al. evaluaron el efecto de la exposición RF-EMF de 3,5 GHz no modulada con un SAR de 0, 2, 4 o 10 W/kg durante 72 h sobre el comportamiento similar a la ansiedad y la corteza auditiva (ACx) en conejillos de Indias. Este estudio señaló un aumento dependiente de SAR en el estrés oxidativo, la inducción de apoptosis y el daño ultraestructural en ACx sin aumento en los umbrales de ansiedad y audición de los animales11. Finalmente, Bektas et al. evaluó si la señal de 3,5 GHz modulada por GSM inducía un cambio en la homeostasis energética y el equilibrio redox en los cerebros de ratas sanas y diabéticas expuestas durante 2 horas al día durante 30 días a una SAR calculada de 0,323 W/kg en el cerebro12. Después de la exposición a RF-EMF, entre ratas diabéticas y sanas, se observaron niveles reducidos de antioxidantes totales y niveles aumentados de oxidantes totales y H2O2 en los tejidos cerebrales. Estos autores también observaron que RF-EMF provocó la variación en los niveles hormonales que influyen en la ingesta de alimentos y el metabolismo energético en el cerebro y aumentó el número de neuronas degeneradas en el hipocampo. En conjunto, estos estudios sugieren un efecto potencial de la RF-EMF de 3,5 GHz en varias vías de respuesta al estrés en organismos eucariotas.

Evaluar si las nuevas tecnologías RF-EMF inducen una respuesta de estrés celular en condiciones de exposición bien controladas es, por lo tanto, uno de los pasos obligatorios en la hoja de ruta para la evaluación de riesgos para la salud de las señales 5G. En particular, a nivel molecular, se ha debatido mucho si se inducen la expresión de proteínas de choque térmico (HSP) y las vías de transducción de señales RAS/MAPK debido al papel central que desempeñan estos sistemas moleculares en las respuestas de estrés de las células13,14. También quedan preguntas con respecto a la aparición de estrés oxidativo en células expuestas a RF-EMF15. Por lo tanto, es crucial evaluar más a fondo el efecto de las señales de RF recién implementadas, como la señal 5G, en los mecanismos moleculares genéricos involucrados en la respuesta al estrés celular. En el presente estudio, investigamos el efecto de una señal RF-EMF de 3,5 GHz modulada por 5G en el factor de choque térmico 1 (HSF1) basal e inducido químicamente, el virus del sarcoma RAt (RAS) y las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK) quinasas y actividades de leucemia promielocítica (PML).

HSF1 es el "regulador maestro" de la transcripción de proteínas de choque térmico en eucariotas16. Las quinasas RAS y ERK son elementos clave de las cascadas de proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) Ser/Thr que transmiten señales extracelulares a procesos intracelulares después de la activación de RAS17,18. La vía de señalización RAS/MAPK es fundamental en la regulación de varios procesos celulares, como la expresión génica, el crecimiento celular y la supervivencia. Finalmente, la proteína PML es la piedra angular de la formación de cuerpos nucleares de PML (PML NB). Son dominios nucleares esféricos que se forman en respuesta a diversas condiciones de estrés, incluido el estrés oxidativo, y que son de suma importancia para la apoptosis, la senescencia, la reparación del ADN, el control epigenético y el control de la oncogénesis19. Por lo tanto, la formación de NB de PML es un marcador de las respuestas de estrés celular y también es importante para la actividad de numerosos factores de transcripción y proteínas nucleares, incluidos HSF1 y ERK20,21,22,23,24. Nuestro estudio utilizó fibroblastos y queratinocitos de piel humana como modelos celulares, ya que las células de la piel se convertirán en el tejido objetivo principal de la exposición 5G a considerar para la evaluación de riesgos25. Estas celdas se expusieron de forma continua o intermitente (5 min ENCENDIDA/10 min APAGADA) a la señal RF-EMF de 3,5 GHz modulada por 5G a 0,25, 1 y 4 W/kg en condiciones isotérmicas durante 24 h antes de HSF1, RAS, ERK, y se evaluaron las actividades de PML, gracias a sondas moleculares basadas en transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) muy usadas13,14,26.

Los sensores RAS y ERK BRET se desarrollaron reemplazando el donante de energía fluorescente (ECFP o Turquoise-GL) y el aceptor de energía fluorescente (YPet-M) de las sondas EKAREV y RaichuEV-ras FRET27 con nanoLuciferase (nLuc28) y mNeonGreen (mNeonG29), respectivamente. El Dr. Matsuda M (Universidad de Kyoto, Japón) proporcionó amablemente las sondas FRET de codificación de vectores de expresión de mamíferos ERK (pEKAREV) y RAS (pRaichuEV-Ras). El ADNc que codifica para nLuc y mNeonG se sintetizó primero (Genescript, Rijswijk, Países Bajos) y luego se clonó en lugar del donante de energía fluorescente, entre NotI y XbaI, en los vectores de expresión pEKAREV y pRaichuEV-Ras.

El ADNc que codifica las proteínas nLuc-HSF1 y mNeonG-HSF1 se derivó de los vectores de expresión rLuc-HSF1 y sYFP2-HSF113, en los que los grupos Renilla Luciferase II y sYFP2 fueron reemplazados por nLuc y mNeonG, respectivamente, entre BamHI y EcoRI. El vector de expresión HSP90 también fue descrito en Poque et al.13.

De manera similar, el ADNc que codifica las proteínas nLuc-PMLIII y mNeonG-SUMO1 se derivó de los vectores de expresión rLuc-PMLIII e YFP-SUMO126, en los que Renilla Luciferase e YFP fueron reemplazados por nLuc y mNeonG, respectivamente, entre BamHI y EcoRI.

As2O3 (A1010, solución madre 330 mM resuspendida en NaOH 1 N) y MG132 (C2211, Z-Leu-Leu-Leu-al, solución madre 50 mM resuspendida en DMSO) eran de Sigma (Lyon, Francia). El forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) se adquirió de Tocris (Bristol, Reino Unido) y Coelenterazine H de Nanolight Technology (Pinetop, AZ, EE. UU.).

Hemos utilizado la línea de fibroblastos de piel inmortalizada SV-40 establecida a partir de una mujer de 19 años con xeroderma pigmentoso (XP), grupo de complementación D, la línea XP6BE30 suministrada por el Instituto Coriell (Camden, NJ). Los fibroblastos XP6BE se mantuvieron en medio-alto nivel de glucosa (DMEM) de Eagle modificado por Dulbecco (D6429, Sigma) suplementado con suero fetal bovino al 10 %, 100 unidades mL-1 de penicilina y estreptomicina. Los queratinocitos HaCaT31 se mantuvieron en Keratinocyte-SFM (Ref 17005-034; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) complementado con extracto de pituitaria bovina (BPE; número de catálogo 13028-014, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y EGF recombinante humano (número de catálogo 10450-13, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) suministrado con el kit Gibco™ Keratinocyte-SFM Supplement (Ref 37000015, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Veinticuatro horas antes de la transfección, las células se sembraron a una densidad de 500.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos. Las transfecciones transitorias se realizaron utilizando polietilenimina (PEI, lineal, MW 25 000; número de catálogo 23966 Polysciences, Inc., Warrington, PA, EE. UU.) con una relación PEI:ADN de 4:1, como se describió anteriormente32. Para medir la actividad de HSF1, se cotransfectaron 0,1 µg del vector de expresión nLuc-HSF1 con 1,4 µg de mNeonG-HSF1 y 0,5 µg de vectores de expresión HSP90. Para medir las actividades de RAS y ERK, se cotransfectaron 1 µg de vectores de expresión pEKAREV o pRaichuEV-Ras BRET con 1 µg de vector vacío. Para medir la actividad de PML, se cotransfectaron 0,1 µg del vector de expresión nLuc-PMLIII con 1,9 µg de mNeonG-SUMO1. Después de la incubación durante la noche, las células transfectadas se separaron, se resuspendieron en DMEM sin fenol rojo (Ref. 21063-029, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se volvieron a colocar en placas a una densidad de 105 células por pocillo en placas blancas de 96 pocillos con fondos transparentes (Greiner Bio one, Courtaboeuf, Francia) pretratados con d-polilisina (Sigma, Lyon, Francia) para lectura con el luminómetro Tristar2 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania) o sobre cubreobjetos de vidrio de 12 mm de diámetro (Knittel Glass , Braunschweig, Alemania) tratada con d-polilisina para la lectura con el espectrómetro SpectraPro 2300i (Acton Optics, Acton, MA, EE. UU.) (ver más abajo). Las células se dejaron en cultivo durante 24 horas antes de procesarlas para el ensayo BRET.

Las células se expusieron de forma simulada durante 24 h (es decir, las células se cultivaron en ausencia de RF-EMF) o se expusieron a las condiciones de exposición de RF-EMF indicadas durante 24 h. Durante las últimas 18 h, 4 ho 15 min de exposición simulada o RF, las células se incubaron con la concentración indicada de MG132, As2O3 o PMA respectivamente (Fig. 1A). Solo se probó un producto químico en cada placa de 96 pocillos; sin embargo, se probaron varias concentraciones del mismo compuesto químico simultáneamente en una sola placa mediante la inyección de soluciones madre 10X precalentadas a 37 °C con una pipeta multicanal. Cuando se indicó, se realizó un tratamiento simulado inyectando solo el agente solvatante en el medio de cultivo celular (DMSO para MG132 y PMA o agua para As2O3). Para realizar el tratamiento químico, las placas se retiraron de la cámara de reverberación (ver más abajo exposición, configuración de exposición y dosimetría" de Material y métodos) e inmediatamente se acoplaron a un calentador Peltier de microplacas Thermostat Plus (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) para mantener las celdas a 37 °C. Las placas expuestas simuladamente se trataron de la misma manera. Retirar la placa de la cámara de reverberación, enviar los productos químicos a las distintas concentraciones en los medios de cultivo celular con una pipeta multicanal y volver a colocar las células en la cámara de reverberación tomó menos de 1 minuto. Después de completar la exposición a RF restante, se agregó Coelenterazine H 5 µM al medio de cultivo celular y la señal BRET se adquirió inmediatamente utilizando un lector de microplacas TriStar2 LB942 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania) precalentado a 37 °C y equipado con filtros de emisión centrados en 515 ± 20 nm para mNeonG (Iacceptor) y 460 ± 20 nm para nLuc (Idonor). Alternativamente, para la medición BRET en tiempo real bajo exposición a RF-EMF, se agregó Coelenterazine H 5 µM al medio de cultivo celular 10 min antes del final de la exposición a RF-EMF y los espectros BRET completos se registraron de forma remota durante los últimos 5 min de Exposición a RF-EMF y los 5 minutos siguientes en ausencia de RF-EMF. Los espectros BRET completos se adquirieron utilizando una fibra óptica conectada a un espectrógrafo de imágenes IsoPlane SCT-320 equipado con un sistema de cámara CCD retroiluminado BLAZE:400B para registrar el espectro visible completo (Teledyne France—Princeton Instruments, Lisses, Francia).

(A) Cronología de la exposición a RF-EMF y adición de fármacos químicos en el medio de cultivo celular. Se aplica RF-EMF (o exposición a RF simulada) durante 24 h cualquiera que sea el fármaco considerado, que se inyecta durante el período indicado. (B,C) Variación de temperatura en placas expuestas a una señal RF-EMF de 3,5 GHz modulada por 5G continua (B) o intermitente (C) a 4 W/kg. La temperatura en la incubadora se ajustó para garantizar la exposición celular a 37 °C y para compensar el aumento de temperatura inducido por RF EMF al inicio del período de exposición. La inyección de fármacos induce una caída transitoria de menos de 0,5 °C en la temperatura del cultivo celular (B).

La señal BRET se determinó calculando el cociente de la intensidad de emisión medida en la ventana aceptora (ImNeonG) sobre la intensidad de emisión medida en la ventana donante (InLuc), según la Eq. (1)

Debido a la superposición de los espectros de emisión de nLuc y mNeonG, una fracción de la luz detectada en el filtro mNeonG se origina en la emisión de luciferasa, lo que genera una señal contaminante33. En esa configuración, el BRET neto se definió, por lo tanto, como la relación BRET de células que coexpresan construcciones nLuc y mNeonG menos la relación BRET de células que expresan solo la construcción nLuc en el mismo experimento.

Se utilizó el software GraphPad Prism v8.00 para Mac (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.) para trazar curvas de dosis-respuesta y realizar análisis estadísticos. El tamaño de las barras de error indica la SD dentro del conjunto de datos. Las curvas dosis-respuesta sigmoideas se ajustaron utilizando la ecuación. (2):

donde X es el logaritmo de la concentración del agonista e Y la respuesta; Inferior es el valor de Y en la meseta inferior y se toma como la medida del nivel basal de activación de las diversas sondas; Top es el valor de Y en la meseta superior y Top-Bottom se toma como la medida de la eficacia máxima de un tratamiento químico dado en cada sonda BRET; Log EC50 es el valor X cuando la respuesta está a mitad de camino entre Bottom y Top (Supp. Fig. 1). El valor EC50 representa, por lo tanto, una medida de la potencia aparente de los diversos compuestos químicos para desencadenar la activación de su sonda BRET afín (Supp. Fig. 1). Las potencias de los productos químicos para activar o inhibir las diferentes sondas se expresan como pEC50 ± SEM (error estándar de la media), que es igual a –log EC50.

Se utilizó la prueba de rango con signo de Wilcoxon de una muestra para evaluar la significación estadística frente a la hipótesis nula de las diferencias calculadas en cada experimento independiente entre las condiciones de exposición simuladas (sin condiciones de RF EMF) y RF-EMF para BRET basal, potencias y eficacias de los productos químicos. (en lo sucesivo denominados ΔBasal BRET, ΔpEC50 y ΔMax eficacia, respectivamente). Se indica el número total de experimentos independientes (n) realizados para cada condición experimental. Se realizó una exposición simulada para cada condición de exposición RF-EMF. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Las células se expusieron durante 24 h en placas de cultivo de tejidos (TCP) de 96 pocillos a niveles de SAR de 0,25, 1 y 4 W/kg. Se implementó la exposición intermitente (5 min ENCENDIDO/10 min APAGADO) al mismo nivel promedio de SAR que con el modo de onda continua (CW) para imitar la exposición real de la vida real y ayudar a detectar posibles efectos biológicos no térmicos. Las exposiciones simuladas de RF EMF también se realizaron en condiciones experimentales idénticas pero con el generador apagado, es decir, con un SAR igual a 0 W/kg. Se utilizó por primera vez un novedoso sistema de exposición, recientemente diseñado y caracterizado, para exposiciones de células a señales de 3,5 GHz moduladas por 5G34. El sistema se basó en una incubadora de cultivo celular que permitió mantener las condiciones biológicas deseadas de 37 °C y 5% de CO2. La caracterización integral del sistema, a través de mediciones experimentales y simulaciones numéricas, se ha descrito en detalle en otro lugar34. En resumen, se utilizó como cámara de reverberación una incubadora de 150 l (BINDER Gmbh, Tullingen, Alemania), construida con paredes de acero inoxidable, es decir, una gran cavidad metálica cerrada, con un factor Q alto, donde una estadísticamente homogénea, La distribución del campo polarizado aleatoriamente e isotrópico se logró mediante la agitación mecánica de los componentes del campo35. Se envió una señal electromagnética a 3,5 GHz a las muestras biológicas a través de una antena de parche impresa. Se usó un soporte de plástico con cinco niveles para acomodar y exponer simultáneamente diez TCP de 6 o 96 pocillos, es decir, dos por nivel de soporte. Cada pocillo de los TCP de 6 y 96 pocillos se llenó con 2 ml y 200 µl de medio de cultivo celular, respectivamente. Para garantizar la reproducibilidad experimental durante la exposición, la incubadora se cargó con la misma configuración utilizada para la caracterización electromagnética, es decir, cuatro y seis TCP de 6 y 96 pocillos, respectivamente, debido a la alta dependencia del SAR de la carga de la cámara.

La unidad de generación de señales, compuesta por un generador de señales de RF (SMBV100A, Rohde & Schwarz, Munich, Alemania), un amplificador de ganancia de 45 dB (Mini-circuitos, ZHL-16W-43+, NY, EE. UU.), un circulador de potencia ( Pasternack, PE83CR1005, CA, EE. UU.) y un acoplador bidireccional (Mini-circuits, ZGBDC30-372HP+, NY, EE. UU.), fuera de la incubadora. Además, para asegurar el monitoreo continuo de la potencia de entrada deseada en la cámara, se monitorearon las potencias incidente y reflejada con un medidor de potencia (Agilent N1912A, EE. UU.) conectado al acoplador bidireccional.

El SAR local se recuperó experimentalmente a través de mediciones de temperatura del calentamiento inducido por RF-EMF registrado con una sonda de fibra óptica (Luxtron One, Lumasense Technologies, CA, EE. UU.). El SAR medido en el TCP de 96 pozos fue de alrededor de 1 W/kg por vatio de potencia de entrada de la antena. Para validar nuestros sistemas, se realizaron simulaciones numéricas utilizando la metodología electromagnética basada en el dominio de tiempo de diferencia finita (FDTD)36. Los resultados de las simulaciones se promediaron sobre 50 posiciones del agitador, correspondientes a una rotación completa. Si bien las simulaciones numéricas pueden no garantizar la ausencia de puntos críticos en ubicaciones específicas de los pozos expuestos, la agitación continua de los componentes del campo a través de la rotación mecánica del agitador metálico aseguró el logro de una buena homogeneidad de SAR con una variación dentro del 30 %. En general, mostramos que los SAR experimentales y numéricos estaban en buena concordancia con diferencias < 30 % considerando la desviación estándar que cumple con las pautas ICNIRP3. Según los valores medidos y simulados normalizados a 1 W, la potencia incidente durante la exposición biológica se ajustó para obtener los niveles de exposición necesarios de 0,25, 1 y 4 W/kg en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. También se realizaron mediciones de la elevación de temperatura inducida del medio expuesto utilizando la sonda Luxtron (Lumasense) bajo la condición de exposición celular específica del estudio, mostrando un aumento de temperatura de 1,7 °C a 4 W/kg, 0,7 °C a 1 W /kg y un aumento de temperatura insignificante por debajo de 0,1 °C a 0,25 W/kg usando una exposición continua a RF, y un aumento de temperatura de 0,8 °C a 4 W/kg, 0,3 °C a 1 W/kg y menos de 0,1 °C a 0,25 W/kg usando una exposición a RF intermitente (5 min ENCENDIDO, 10 min APAGADO). La temperatura de la incubadora se disminuyó en consecuencia para mantener las muestras biológicas a 37 °C. La estabilidad de la temperatura de los cultivos celulares en el fondo de los pocillos de cultivo durante todas las sesiones de RF en los distintos niveles de SAR se evaluó cuidadosamente en un conjunto de placas separadas (ver Fig. 1B, C para trazas de temperatura típicas obtenidas a 4 W/kg bajo condiciones continuas). y condiciones de exposición intermitente, respectivamente). Como era de esperar, la temperatura del cultivo celular expuesto a la señal intermitente oscila ligeramente (Fig. 1C). Cabe destacar que la inyección del producto químico desencadenó una caída transitoria en la temperatura del cultivo celular de menos de 0,5 °C, como se ejemplifica en la Fig. 1B.

La hipótesis de que el RF-EMF de 3,5 GHz modulado por 5G puede afectar la actividad basal o inducida químicamente de HSF1, RAS, ERK o PML se probó mediante ensayos basados en BRET descritos anteriormente por nuestro equipo13,14,26. BRET es un ensayo basado en células para estudiar las interacciones proteína-proteína y los cambios conformacionales de proteínas en células vivas y en tiempo real. Esta técnica se basa en la transferencia de energía de resonancia de Forster de un donante bioluminiscente a un aceptor fluorescente, ambos fusionados con las proteínas de interés. En nuestro diseño experimental, las sondas BRET se expresaron en células vivas. Dado que las líneas celulares de fibroblastos y queratinocitos utilizadas en este estudio son más difíciles de transfectar que las células HEK293T utilizadas en nuestros estudios anteriores, reemplazamos sistemáticamente la proteína rLuc2 en nuestros ensayos BRET con la nanoluciferasa (nLuc)28 más brillante. También reemplazamos el aceptor fluorescente sYFP2 con mNeonGreen (mNeonG) en todos nuestros ensayos debido a la mayor superposición entre los espectros de emisión de nLuc y los espectros de excitación de mNeonG37.

Para monitorear la actividad de HSF1, diseñamos previamente una prueba BRET intermolecular que permite el seguimiento de la trimerización de HSF113, un evento clave en la hoja de ruta de la activación de HSF1 en respuesta a condiciones de estrés como el estrés por calor, estrés oxidativo o estrés proteotóxico38. En este ensayo, HSF1 etiquetado con nLuc en el extremo N se coexpresa con HSF1 etiquetado con mNeonG en una línea celular determinada. Dado que HSF1 se trimeriza tras la activación, la señal BRET resultante aumenta después de la activación de HSF1, ya que la trimerización acerca a los grupos donante y aceptor13 (Fig. 2A).

Efecto de la exposición continua o intermitente a la señal 5G sobre la activación de HSF1 en fibroblastos XP6BE. (A) Modo de acción del ensayo intermolecular HSF1 BRET. (B) Curvas de dosis-respuesta de los cambios inducidos por MG132 en la señal BRET de nLuc-HSF1/mNeonG-HSF1. Las células de fibroblastos XP6BE que coexpresan transitoriamente las proteínas nLuc-HSF1 y mNeonG-HSF1 se activaron durante 18 h a 37 ° C con una concentración creciente de MG132 antes de la medición BRET. Los resultados representan el promedio ± SEM de 10 experimentos independientes realizados por duplicado. La pEC50 de MG132 fue de 6,83 ± 0,25 mientras que la eficacia máxima de MG132 fue de 0,106 ± 0,018. (C-E) Los fibroblastos de piel XP6BE transfectados con la sonda BRET nLuc-HSF1/mNeonG-HSF1 fueron expuestos de forma simulada o expuestos a 3,5 GHz modulados por 5G a 0,25, 1 o 4 W/kg durante 24 h de forma continua o intermitente (5 min ENCENDIDO/10 min APAGADO). Las células se activaron usando concentraciones crecientes de MG132 bajo exposición simulada o RF-EMF durante las últimas 18 h del período de exposición RF-EMF antes de realizar la medición BRET. Los resultados en los paneles CE representan los diagramas de caja y bigotes de la variación BRET basal (C), la variación de potencia MG132 (D) y la variación de eficacia máxima MG132 (E) entre el 5G RF-EMF expuesto- (Expo) y condiciones falsas en modo de exposición continua e intermitente (encendido/apagado). La significación estadística de la derivación de la hipótesis nula (sin diferencia entre la exposición simulada y RF-EMF) se evaluó mediante la prueba de rango con signo de Wilcoxon de una muestra. n = 6–12 dependiendo de la condición experimental. ns no significativo; *p < 0,05; ** p < 0,01.

Para evaluar la funcionalidad de este ensayo en fibroblastos de la piel, coexpresamos nLuc-HSF1 con mNeonG-HSF1 en la línea celular de fibroblastos XP6BE39 y desafiamos las células transfectadas con concentraciones crecientes del inhibidor del proteasoma MG132 para desencadenar un estrés proteotóxico40. Como era de esperar, MG132 indujo un aumento dependiente de la concentración en la señal BRET basal con un EC50 en el rango de cien nanomolar (Fig. 2B), lo que demuestra la eficacia del ensayo.

Luego evaluamos si la exposición celular continua o intermitente (5 min ENCENDIDA/10 min APAGADA) a la señal RF-EMF de 3,5 GHz modulada por 5G a 0,25, 1 y 4 W/kg en condiciones isotérmicas durante 24 h afectó el nLuc-HSF1/ Señal BRET basal de mNeonG-HSF1, o la potencia o eficacia de MG132 para activar HSF1 en la línea celular de fibroblastos XP6BE transfectada. Curiosamente, medimos una disminución pequeña pero significativa y reproducible del BRET basal HSF1 cuando la línea celular de fibroblastos XP6BE se expuso continuamente a 0,25 W/kg durante 24 h o se expuso de forma intermitente a 0,25 y 1 W/kg durante 24 h (Fig. 2C) . Si bien esta disminución de la señal BRET representa solo ~ 6 a 10% del BRET basal medido, corresponde proporcionalmente a ~ 37 a 61% (en términos absolutos) del efecto desencadenado por MG132 (Tablas 1 y 2). No se midió ningún efecto a 4 W/kg tanto si la señal se emitía de forma continua como intermitente. Además, la exposición a la señal RF-EMF no cambió ni la potencia de MG132 ni su eficacia para activar HSF1, independientemente de la SAR y el modo de emisión continua o intermitente de la señal (Fig. 2D, E, Tablas 3 y 4).

Para evaluar el impacto potencial de las exposiciones RF-EMF de 3,5 GHz moduladas por 5G en la actividad de RAS inducida químicamente o basalmente, las células de fibroblastos XP6BE se transfectaron con una sonda BRET que consiste en intercalar el H-Ras y el dominio Ras-Binding de Raf ( Raf RBD) entre nLuc y mNeonGreen. Esta sonda BRET molecular se deriva de la sonda de Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia (FRET) descrita por el laboratorio Matsuda27,41, y se basa en el acercamiento de nLuc y mNeonG tras la unión de GTP-Ras a Raf RBD (Fig. 3A).

Efecto de la exposición continua o intermitente de 5G RF-EMF en la activación de RAS en fibroblastos de piel XP6BE. (A) Modo de acción del biosensor RAS BRET. (B) Curvas de dosis-respuesta del cambio inducido por PMA en la actividad RAS utilizando la sonda pRaichuEV-Ras BRET. Los fibroblastos XP6BE se activaron durante 15 min a 37 °C con una concentración creciente de PMA antes de la medición BRET. Los resultados representan el promedio ± SEM de 10 experimentos independientes realizados por duplicado. La pEC50 de PMA fue de 7,60 ± 0,17 mientras que la eficacia máxima de PMA fue de 0,107 ± 0,012. (C-E) Las células de fibroblastos XP6BE transfectadas con la sonda pRaichuEV-Ras BRET se expusieron de forma simulada o se expusieron a 3,5 GHz modulados por 5G a 0,25, 1 o 4 W/kg durante 24 h, ya sea de forma continua o intermitente (5 min ON/ 10 minutos APAGADO). Las células se activaron usando concentraciones crecientes de PMA bajo exposición simulada o RF-EMF durante los últimos 15 m antes de realizar la medición BRET. Los resultados en los paneles CE representan los diagramas de caja y bigotes de la variación de BRET basal (C), la variación de potencia de PMA (D) y la variación de eficacia máxima de PMA (E) entre el 5G RF-EMF expuesto (Expo) y condiciones falsas en modo de exposición continua o intermitente. La significación estadística de la derivación de la hipótesis nula (sin diferencia entre la exposición simulada y RF-EMF) se evaluó mediante la prueba de rango con signo de Wilcoxon de una muestra. n = 6–12 dependiendo de la condición experimental. ns no significativo; *p < 0,05; ** p < 0,01.

De manera similar, se evaluó el impacto potencial de la exposición de la señal RF-EMF de 3,5 GHz modulada por 5G en la actividad de ERK inducida químicamente o basalmente en células de fibroblastos XP6BE transfectadas con una sonda BRET que comprende un dominio de sensor de ERK y un dominio de ligando de ERK conectado por un flexible enlazador, pero intercalado por un mNeonG y nLuc en lugar de dos aceptores y donantes de energía fluorescente como se describió inicialmente27 (Fig. 4A). Una vez activadas, las proteínas ERK endógenas fosforilan la parte del sensor de esta sonda BRET. Esto desencadena la interacción del dominio del sensor con el dominio del ligando, lo que induce el cierre del biosensor sobre sí mismo. Dicho cambio conformacional acerca a nLuc a mNeonGreen, lo que aumenta la eficiencia de BRET.

Efecto de la exposición continua o intermitente de 5G RF-EMF en la activación de ERK en fibroblastos de piel XP6BE. (A) Modo de acción del biosensor ERK BRET. (B) Curvas de dosis-respuesta del cambio inducido por PMA en la actividad de ERK utilizando la sonda pEKAREV BRET. Los fibroblastos XP6BE se activaron durante 15 min a 37 °C con una concentración creciente de PMA antes de la medición BRET. Los resultados representan el promedio ± SEM de 10 experimentos independientes realizados por duplicado. La pEC50 de PMA fue de 7,72 ± 0,15 mientras que la eficacia máxima de PMA fue de 0,178 ± 0,018. (C-E) Las células de fibroblastos XP6BE transfectadas con la sonda pEKAREV BRET fueron expuestas de forma simulada o expuestas a 3,5 GHz moduladas por 5G a 0,25, 1 o 4 W/kg durante 24 h, ya sea de forma continua o intermitente (5 min ON/10 min APAGADO). Las células se activaron usando concentraciones crecientes de PMA bajo exposición simulada o RF-EMF durante los últimos 15 m antes de realizar la medición BRET. Los resultados en los paneles CE representan los diagramas de caja y bigotes de la variación de BRET basal (C), la variación de potencia de PMA (D) y la variación de eficacia máxima de PMA (E) entre el 5G RF-EMF expuesto (Expo) y condiciones falsas en modo de exposición continua o intermitente. La significación estadística de la derivación de la hipótesis nula (sin diferencia entre la exposición simulada y RF-EMF) se evaluó mediante la prueba de rango con signo de Wilcoxon de una muestra. n = 6–12 dependiendo de la condición experimental. ns no significativo; *p < 0,05; ** p < 0,01.

Por lo tanto, los fibroblastos XP6BE que expresan transitoriamente estas sondas BRET sensibles a RAS y ERK se desafiaron durante 15 minutos con forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), un conocido éster de forbol que imita al diacilglicerol que conduce a la activación de RAS y dependiente de PKC. ERK42. Como se esperaba, PMA indujo un aumento dependiente de la concentración del BRET medido con las sondas BRET RAS (Fig. 3B) y ERK (Fig. 4B). Además, para ambas sondas BRET, la EC50 medida estuvo en el rango de decenas de nanomolar, lo que nuevamente demuestra la alta sensibilidad de nuestros ensayos basados en BRET para monitorear la activación de RAS y ERK.

La exposición continua o intermitente de fibroblastos XP6BE que expresan transitoriamente las sondas RAS y ERK a una señal de RF-EMF de 3,5 GHz modulada por 5G durante 24 h no afectó a RAS y ERK BRET basal (Figs. 3C y 4C, Tabla 1 y 2) ni a la potencia de PMA ( Figs. 3D y 4D, Tabla 3) o eficacia máxima (Figs. 3E o 4E, Tabla 4) para activar estas quinasas. Solo medimos una ligera disminución en la potencia de PMA para activar ERK en fibroblastos XP6BE expuestos continuamente durante 24 h a un SAR de 0, 25 W / kg (Fig. 4D, Tabla 3).

Finalmente, sabiendo que la adición covalente postraduccional de SUMO a PML, un proceso conocido como SUMOylation, es un evento clave que conduce a la activación de PML y la formación de NB de PML, utilizamos un ensayo BRET intermolecular26 para evaluar si 5G- continuo o intermitente. La exposición a la señal RF-EMF modulada de 3,5 GHz puede afectar la actividad de la PML. En este ensayo, medimos la señal BRET entre una proteína SUMO1 N-terminal etiquetada con mNeonGreen y una proteína PMLIII C-terminal etiquetada con nLuc (Fig. 5A). Por lo tanto, los fibroblastos XP6BE transfectados transitoriamente con vectores de expresión PMLIII-nLuc/mNeonG-SUMO1 fueron desafiados con trióxido de arsénico (As2O3), un conocido inductor del estrés oxidativo en las células43 que desencadena de manera eficiente la SUMOilación de PML26,44. Como era de esperar, As2O3 aumentó de forma dependiente de la dosis la señal BRET entre PMLIII-nLuc y mNeonG-SUMO1 en células de fibroblastos XP6BE con un EC50 en el rango de decenas de nanomolar (Fig. 5B), lo que indica una eficiente SUMOilación de PML en estas células. Además, ni la SUMOilación basal de PML ni la potencia de As2O3 o la eficacia máxima para desencadenar la SUMOilación de LMP se vieron afectadas después de la exposición intermitente de fibroblastos XP6BE transfectados transitoriamente a una señal RF-EMF de 3,5 GHz modulada con 5G durante 24 h, independientemente del SAR probado (Fig. 5C-E). ). Sin embargo, medimos una disminución leve pero reproductiva en la SUMOilación basal de PML cuando los fibroblastos XP6BE se expusieron continuamente durante 24 h a 4 W / kg (Fig. 5C). Esta variación representó menos del 3,5 % de la señal BRET basal de PML (Tabla 1) y el 14,9 % de la eficacia máxima de As2O3 (en términos absolutos) (Tabla 2). Además, la exposición continua durante 24 h no cambió la potencia de As2O3 para desencadenar la SUMOilación de PML (Fig. 5D, Tabla 3), pero provocó una ligera disminución en la eficacia máxima de As2O3 en comparación con la condición (Fig. 5E, Tabla 4).

Efecto de la exposición continua o intermitente a 5G-EMF en la SUMOilación de PML en fibroblastos de piel XP6BE. (A) Descripción esquemática de los ensayos BRET intermoleculares para la detección de SUMOilación de PML. (B) Curvas de dosis-respuesta de la SUMOilación de PML inducida por As2O3 mediante el ensayo intermolecular PML-nLuc/mNeonGreen-SUMO1. Los fibroblastos XP6BE se activaron durante 4 h a 37 °C con una concentración creciente de As2O3 antes de la medición BRET. Los resultados representan el promedio ± SEM de 10 experimentos independientes realizados por duplicado. La pEC50 de As2O3 fue de 7,19 ± 0,15 mientras que la eficacia máxima de PMA fue de 0,161 ± 0,014. (C-E) Los fibroblastos XP6BE cotransfectados con el vector de expresión de mamífero que codifica PML-nLuc y mNeonGreen-SUMO1 fueron expuestos de forma simulada o expuestos a 3,5 GHz modulados por 5G a 0,25, 1 o 4 W/kg durante 24 h, ya sea de forma continua o intermitentemente (5 min ON/10 min OFF). Las células se activaron usando concentraciones crecientes de As2O3 bajo exposición simulada o RF-EMF durante las últimas 4 h antes de realizar la medición BRET. Los resultados en los paneles CE representan los diagramas de cajas y bigotes de la variación basal de BRET (C), la variación de potencia de As2O3 (D) y la variación de eficacia máxima de As2O3 (E) entre el 5G RF-EMF expuesto (Expo) y condiciones falsas en modo de exposición continua o intermitente. La significación estadística de la derivación de la hipótesis nula (sin diferencia entre la exposición simulada y RF-EMF) se evaluó mediante la prueba de rango con signo de Wilcoxon de una muestra. n = 6–12 dependiendo de la condición experimental. ns no significativo; *p < 0,05; ** p < 0,01.

A continuación, evaluamos si no habíamos pasado por alto un efecto potencial de la exposición a RF que podría haber desaparecido durante los breves intervalos de tiempo entre el final de la exposición y la finalización de la lectura BRET (menos de 5 min). Para verificar esta hipótesis, se añadió coelenterazina H a los pocillos de cultivo celular para iniciar la reacción bioluminiscente 10 min antes del final de la exposición de las células a la señal de 3,5 GHz modulada por 5G emitida de forma continua a 4 W/kg. Luego, utilizando una fibra óptica, medimos de forma remota la relación BRET en tiempo real durante los 5 últimos minutos del período de exposición RF-EMF de 24 h y seguimos midiendo durante los 5 minutos siguientes sin exposición a RF. Como se indica en la Fig. 6, independientemente de la sonda BRET considerada, y en presencia o ausencia de activación química, no detectamos ninguna variación de la señal BRET después del final de la exposición a RF, lo que valida los resultados obtenidos previamente.

Monitoreo en tiempo real de la variación BRET después del apagado de RF-EMF. Las células HEK293T que se transfectaron con las sondas BRET HSF1 (A), RAS (B), ERK (C) o PML (D) se expusieron a 3,5 GHz moduladas por 5G a 4 W/kg durante 24 h y se simularon tratados o tratadas con 1 µM de PMA, 10 µM de As2O3 o 10 µM de MG132 según el cronograma indicado en la Fig. 1A. Se inyectó coelenterazina H en los medios de cultivo celular 10 minutos antes del final de la exposición a RF-EMF. Las señales BRET se midieron de forma remota durante los últimos 5 minutos antes del final de la exposición a RF-EMF y durante los siguientes 5 minutos después del final de la exposición a RF-EMF. Para cada sonda BRET, la cinética de la evolución de la señal BRET se muestra en células tratadas con simulacro y tratadas con fármacos, y representa el promedio de 3 a 4 experimentos independientes.

En un esfuerzo adicional para estudiar el efecto potencial de la señal 5G en las células de la piel y dado que la capa superior de la piel (epidermis) está compuesta principalmente de queratinocitos, realizamos un nuevo conjunto de experimentos utilizando la línea celular de queratinocitos HaCaT para evaluar si un La exposición continua de 24 h a RF-EMF de 3,5 GHz modulada por 5G puede afectar las actividades de HSF1, RAS, ERK y PML. Las células HaCaT transfectadas transitoriamente con las sondas BRET que sondeaban HSF1, RAS, ERK y PMLIII fueron desafiadas, respectivamente, con una concentración creciente de MG132 (para HSF1), PMA (para RAS y ERK) y As2O3 (para PML) después de un tratamiento simulado o continuo. exposición a RF-EMF de 3,5 GHz modulada por 5G durante 24 h a tres SAR diferentes de 0,25, 1 y 4 W/kg. Se generaron curvas de dosis-respuesta para cada condición experimental (consulte la Fig. 2 complementaria para ver las curvas derivadas de la condición de exposición simulada). Por lo tanto, se calculó el BRET basal de cada sonda y la potencia y la eficacia máxima de cada agente químico, y la variación de cada parámetro entre las condiciones de exposición simulada y las expuestas a RF-EMF se informó en la Fig. 7. No encontramos diferencias entre las condiciones simuladas y expuestas. condiciones, cualquiera que sea el objetivo molecular, el SAR o la métrica considerada. La única excepción fue un ligero aumento en la eficacia máxima de PMA para activar ERK cuando las células HaCaT se expusieron a 1 W/kg.

Efecto de la exposición continua o intermitente de 5G RF-EMF en las actividades de HSF1, ERK, RAS y PML en queratinocitos HaCaT. Células de queratinocitos HaCaT que expresan transitoriamente construcciones HSF1, ERK, RAS y PML fueron expuestas de forma simulada o expuestas a 3,5 GHz moduladas por 5G a 0,25, 1 o 4 W/kg durante 24 h, ya sea de forma continua o intermitente (5 min ON/10 min OFF ). Las células se activaron usando concentraciones crecientes de MG132 (HSF1), PMA (RAS y ERK) o As2O3 (PML) bajo exposición simulada o RF-EMF durante las últimas 18 h (HSF1), 15 min (RAS y ERK) o 4 h (PML) del período de exposición RF-EMF. Luego se detuvo la exposición a RF-EMF y las señales BRET se midieron inmediatamente. Para cada curva de respuesta a la dosis, la señal BRET basal, la potencia y la eficacia máxima del agente químico activador se derivaron y se informaron como diagramas de cajas y bigotes de la variación entre las condiciones expuestas (Expo) y simuladas de 5G RF-EMF en condiciones continuas o simuladas. Modo de exposición intermitente. La significación estadística de la derivación de la hipótesis nula (sin diferencia entre la exposición simulada y RF-EMF) se evaluó mediante la prueba de rango con signo de Wilcoxon de una muestra. n = 6–13 dependiendo de la condición experimental. ns no significativo; *p < 0,05; ** p < 0,01.

En este estudio, investigamos si la exposición continua o intermitente (5 min ENCENDIDO/10 min APAGADO) a la señal RF-EMF de 3,5 GHz modulada por 5G a 0,25, 1 y 4 W/kg durante 24 h en condiciones isotérmicas fibroblastos de piel humana afectados y la respuesta al estrés de las células de los queratinocitos a nivel molecular. Usando nuestras propias sondas moleculares basadas en BRET existentes, nos enfocamos en las proteínas HSF1, RAS/ERK y PML que se encuentran en la encrucijada de varias vías moleculares, lo que garantiza una respuesta celular adecuada a una amplia gama de estrés ambiental, incluida la lesión térmica, el estrés oxidativo y estrés proteotóxico38. Evaluamos si la exposición a la señal 5G afectó la actividad basal o activada químicamente para cada uno de estos marcadores moleculares de estrés celular.

Descubrimos que el nivel de BRET basal de HSF1 se redujo cuando las células de fibroblastos XP6BE se expusieron respectivamente a una señal 5G continua e intermitente durante 24 h a 0,25 W/kg y a una señal 5G intermitente durante 24 h a 1 W/kg. No se detectó ningún cambio en la señal BRET basal de HSF1 a 1 W/kg cuando se usó una señal continua o cuando las células se expusieron de forma continua o intermitente a 4 W/kg.

A primera vista, la disminución inducida por RF-EMF de la señal BRET basal HSF1 puede parecer relativamente pequeña, ya que representa solo el 6-11 % de la señal BRET basal HSF1 en el experimento simulado (Fig. 2B). Sin embargo, dado que la activación química con MG132 solo aumentó el BRET basal en 0,1 unidades BRET (es decir, un aumento del 14 % del BRET basal) (Fig. 2B), el efecto de la exposición a 5G RF-EMF parece importante en términos de valores absolutos. Curiosamente, estos resultados son paralelos a los obtenidos previamente por nosotros con células HEK293T expuestas durante 24 h a una señal de 1,8 GHz no modulada (onda continua, CW) o modulada por GSM13. En este trabajo anterior, la exposición a RF-EMF disminuyó ligeramente la actividad basal de HSF1 en el SAR más bajo probado (1,5 W/kg) pero no en el SAR más alto (4 W/kg). Queda por determinar si el efecto de RF-EMF en HSF1 basal puede afectar la respuesta de estrés fisiológica dependiente de HSF1 en organismos expuestos a RF-EMF. En este estudio in vitro anterior, si bien detectamos que la eficacia máxima de MG132 para desencadenar la trimerización de HSF1 en células HEK293T aumentó después de 24 h de exposición a señales CW o GSM a 1,5 W/kg y a señales CW a 6 W/kg13, lo hicimos no detectó ninguna variación de la potencia o eficacia de MG132 para desencadenar la activación de HSF1 después de la exposición a 5G RF-EMF (Fig. 2).

Teniendo en cuenta los otros ensayos BRET realizados en fibroblastos de piel, solo detectamos un ligero desplazamiento hacia la izquierda, menos de un cuarto de logaritmo, de la potencia de PMA para activar ERK a 0,25 W/kg y una pequeña reducción en la eficacia de As2O3 para desencadenar la SUMOilación de PML, pero sólo cuando las células estuvieron continuamente expuestas. No se pudo detectar ningún otro efecto inducido por RF en fibroblastos expuestos a 5G RF-EMF, independientemente de la sonda molecular considerada y del SAR o la envolvente de la señal utilizada. Finalmente, en todos los ensayos realizados en queratinocitos, solo detectamos un aumento de ~ 37 % en la eficacia de PMA para activar ERK a 1 W/kg pero no a 0,25 o 4 W/kg. Es importante destacar que no se detectaron cambios en la medición BRET después del final de la exposición RF-EMF cuando la señal BRET se leyó en tiempo real en células de fibroblastos que se expusieron continuamente durante 24 h a 3,5 GHz modulado 5G a 4 W/kg, dictaminando -out un posible sesgo debido al tiempo necesario para leer nuestra señal BRET en placas de 96 pocillos después del final de la exposición RF-EMF.

En conjunto, estos resultados pueden parecer desconcertantes en varios niveles. Teniendo en cuenta los tipos de celdas utilizados, es notable que la exposición RF-EMF con dos ondas portadoras diferentes (1,8 y 3,5 GHz) y con modulación de señal diferente (modulación CW o GSM en nuestro estudio anterior y modulación 5G en el presente estudio) puede disminuyen constantemente la actividad basal de HSF1 en células renales embrionarias HEK293T13 y fibroblastos cutáneos XP6BE (Fig. 2), pero no en queratinocitos HaCaT (Fig. 7). De manera similar, detectamos que la eficacia máxima de PMA para activar ERK (i) disminuyó cuando las células HEK293T se expusieron a una señal de 1,8 GHz modulada por CW o GSM, (ii) aumentó en los queratinocitos, pero (iii) no se vio afectada en 5G RF- Fibroblastos de piel expuestos a EMF. Finalmente, la eficacia máxima de As2O3 para desencadenar la SUMOilación de PML disminuyó ligeramente en los fibroblastos de la piel cuando se expusieron de forma continua, pero no se modificó en los queratinocitos.

Varios autores ya han informado variaciones cualitativas o cuantitativas en algunos efectos biomoleculares inducidos en diferentes líneas celulares después de su exposición a señales RF-EMF en el rango de GHz en condiciones experimentales idénticas45,46,47. Si bien se espera que diferentes tipos de células puedan responder de manera diferente al mismo estímulo, hasta donde sabemos, ningún equipo de investigación ha aclarado aún por qué y cómo los campos electromagnéticos de RF de bajo nivel pueden afectar la materia viva. Además de la falta de mecanismos no térmicos, también es intrigante que los pocos efectos inducidos por RF-EMF detectados aquí en las actividades de HSF1, ERK y PML no siguen un perfil clásico de dosis-respuesta. Por ejemplo, la inhibición inducida por RF-EMF de la actividad basal de HSF en fibroblastos de piel humana solo se pudo detectar a 0,25 W/kg pero no a 4 W/kg, tanto en exposiciones intermitentes como continuas. Sorprendentemente, a 1 W/kg, no hubo cambios en el BRET basal de HSF1 cuando las células se expusieron continuamente, mientras que el BRET basal de HSF1 disminuyó aún más cuando las células se expusieron de forma intermitente. De manera similar, la eficacia máxima de PMA para activar ERK en queratinocitos aumentó a 1 W/kg pero no a 0,25 W/kg ni a 4 W/kg (Fig. 5). Solo la eficacia máxima de As2O3 para desencadenar la SUMOilación de LMP pareció disminuir de forma dependiente de la dosis con la SAR bajo exposición continua, pero la magnitud de este efecto fue pequeña (Tabla 4).

¿Puede la exposición a RF-EMF a niveles bajos provocar un efecto biológico no térmico mientras que la exposición a RF-EMF a niveles más altos no? Varios autores en este campo de investigación ya han informado sobre el llamado efecto "ventana", donde la exposición a los CEM a intensidades específicas produce un efecto biológico dado que no podría detectarse usando la exposición a los CEM a intensidades más bajas o más altas48,49. Desafortunadamente, no se publicaron más pruebas experimentales sobre dicho efecto de ventana y, en consecuencia, los autores no proporcionaron ninguna explicación sobre el mecanismo molecular subyacente.

Más recientemente, Pooam et al. invocó un efecto dosis-respuesta hormético para explicar que la producción de ROS en células HEK293T expuestas a 1,8 GHz RF-EMF es máxima en una amplitud de señal intermedia50. La hormesis es un concepto toxicológico caracterizado por una respuesta biológica estimulada cuando se expone a una cantidad baja y subtóxica de estresor y por los efectos perjudiciales de niveles altos y tóxicos del mismo estresor51. Además, se ha demostrado que una impresionante variedad de mecanismos moleculares citoprotectores y vías de transducción de señales responden de manera hormética, incluida la activación de HSF1 y ERK52,53. Por lo tanto, si la exposición a RF-EMF, sola o en combinación con un agente activador químico, podría desencadenar o magnificar una respuesta hormética en la actividad de HSF1 o ERK debe estudiarse con más cuidado. Curiosamente, la hormesis también es un proceso dependiente del tiempo54. Cabe destacar que se ha propuesto un efecto hormético dependiente del tiempo para explicar que la exposición corta (1 h) a 1,8 GHz RF-EMF a un SAR promedio de 4,0 W/kg induce la fragmentación del ADN en fibroblastos embrionarios de ratón, mientras que una exposición más prolongada (36 h ) disminuyó la fragmentación del ADN a un nivel más bajo que para la condición simulada55. En consecuencia, dado que solo probamos un tiempo de exposición (24 h), será interesante repetir estos experimentos para evaluar la posible variación dependiente del tiempo de los efectos detectados aquí.

En conclusión, nuestro estudio BRET no muestra pruebas concluyentes de que puedan surgir efectos moleculares cuando las células de la piel se exponen a una señal de 5G RF-EMF (3,5 GHz) durante 24 h, incluso a niveles superiores a las directrices de la ICNIRP para la exposición pública de campos lejanos (0,08 W/Kg). Solo se detectaron unos pocos cambios estadísticamente significativos que dependen de (i) la sonda molecular utilizada, (ii) el tipo de células utilizadas, (iii) la presencia de un agente químico activador, con un tiempo y una dosis más que probables. dependencia, y (iv) las características de la exposición RF-EMF como SAR, frecuencia o modulación de la onda portadora. Dado que usamos más de 100 parámetros experimentales diferentes y que todos menos uno de los efectos detectados tenían un riesgo de error del 5 %, estadísticamente se esperaba que hubiera algunos datos falsos positivos. Llegamos a una conclusión similar cuando estudiamos el efecto de varias señales de 1,8 GHz en cultivos de células cerebrales primarias y líneas celulares de neuroblastoma utilizando técnicas sin etiquetas56. Por lo tanto, aparte del efecto de RF-EMF en la actividad basal de HSF1 que puede merecer más investigaciones, no encontramos evidencia suficiente sobre el efecto fisiológico del RF-EMF probado solo o en combinación con productos químicos.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Gopal, BG Un estudio comparativo sobre tecnología 4G y 5G para aplicaciones inalámbricas. IOSR J. Electron. común Ing. (IOSR-JECE) 10, 67–72 (2015).

Google Académico

Mahmud, M. Tecnologías móviles celulares (1G a 5G) y MIMO masivo. En t. J. Ciencia. Res. (IJSR) 8, 929–937 (2019).

Google Académico

ICNIRP. Pautas para limitar la exposición a campos electromagnéticos (100 kHz a 300 GHz). médico de la salud 118, 483–524 (2020).

Artículo Google Académico

Vecchia, P. et al. Exposición a campos electromagnéticos de alta frecuencia, efectos biológicos y consecuencias para la salud (100 kHz-300 GHz) (ICNIRP, 2009).

Google Académico

Consejo Científico de Campos Electromagnéticos de la SSM. Investigaciones recientes sobre CEM y riesgos para la salud: decimocuarto informe del Consejo científico sobre campos electromagnéticos de SSM, 2019. https://www.stralsakerhetsmyndigheten.se/contentassets/47542ee6308b4c76b1d25ae0adceca15/2020-04-recent-research-on-emf-and-health- riesgo---decimocuarto-informe-del-ssms-scientific-consejo-sobre-campos-electromagnéticos-2019.pdf (2020).

IARC. Radiaciones no ionizantes, parte 2: Campos electromagnéticos de radiofrecuencia. Monogr. IARC Eval. Carcinog. Riesgos Hum. 102, 1–460 (2013).

Google Académico

Dasgupta, S. et al. Impactos de la radiofrecuencia de telefonía móvil de alta dosis de 3,5 GHz en el desarrollo embrionario del pez cebra. PLoS One 15, e0235869 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dasgupta, S. et al. Déficits transcriptómicos y conductuales a largo plazo asociados con la exposición a la radiación de radiofrecuencia de 3,5 GHz en el desarrollo del pez cebra. Reinar. ciencia Tecnología Letón. 9, 327–332 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Y. et al. Las frecuencias de comunicación móvil simuladas (3,5 GHz) emitidas por un generador de señales afectan el sueño de Drosophila melanogaster. Reinar. contaminar 283, 117087 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wang, Y. et al. La radiación electromagnética de radiofrecuencia de 3,5 GHz favorece el desarrollo de Drosophila melanogaster. Reinar. contaminar 294, 118646 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Yang, H. et al. Efectos de la exposición aguda a la radiación electromagnética de radiofrecuencia de 3500 MHz (5G) en el comportamiento similar a la ansiedad y la corteza auditiva en cobayas. Bioelectromagnetismo 43, 106–118 (2022).

Artículo MathSciNet CAS PubMed Google Académico

Bektas, H. et al. Efectos de la radiación de radiofrecuencia de 35 GHz en el nivel de grelina, nesfatina-1 e irisina en cerebros diabéticos y sanos. J. Chem. Neuroanat. 126, 102168 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Poque, E. et al. Efectos de la exposición a campos de radiofrecuencia en la respuesta HSF1 inducida por proteotóxicos e inducida por calor en células vivas utilizando la técnica de transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia. Acompañantes de estrés celular 26, 241–251 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Poque, E. et al. Efectos de los campos de radiofrecuencia sobre la actividad de las cinasas RAS y ERK en células vivas utilizando la técnica de transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia. En t. J. Radiat. Biol. 96, 836–843 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Schuermann, D. & Mevissen, M. Campos electromagnéticos artificiales y estrés oxidativo: efectos biológicos y consecuencias para la salud. En t. J. Mol. ciencia https://doi.org/10.3390/ijms22073772 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Gomez-Pastor, R., Burchfiel, ET & Thiele, DJ Regulación de los factores de transcripción del choque térmico y sus funciones en la fisiología y la enfermedad. Nat. Rev Mol. Biol celular. 19, 4–19 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kim, EK y Choi, E.-J. Señalización MAPK comprometida en enfermedades humanas: una actualización. Arco. Toxicol. 89, 867–882 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Nussinov, R., Tsai, C.-JJ y Jang, H. Isoformas oncogénicas de Ras que señalan la especificidad en la membrana. Cáncer Res. 78, 593–602 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Niwa-Kawakita, M., Wu, H.-C., de Thé, H. & Lallemand-Breitenbach, V. Cuerpos nucleares PML, ¿dominios sin membrana que actúan como sensores ROS?. Semin. Desarrollo celular Biol. 80, 29–34 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Goodson, ML et al. La modificación SUMO-1 regula la actividad de unión al ADN del factor de transcripción de choque térmico 2, un factor de transcripción asociado al cuerpo nuclear de la leucemia promielocítica*. J. Biol. química 276, 18513–18518 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Meng , X. , Chen , Y. , Macip , S. & Leppard , K. PML-II regula la activación de la señalización de ERK y AKT y la muerte celular inducida por IFNα . Comun de celular Señal. Rev. 19, 70 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alastalo, T.-P. et al. La formación de gránulos de estrés nuclear involucra a HSF2 y coincide con la localización nucleolar de Hsp70. J. ciencia celular. 116, 3557–3570 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Akerfelt, M., Morimoto, RI y Sistonen, L. Factores de choque térmico: integradores del estrés celular, el desarrollo y la vida útil. Nat. Rev Mol. Biol celular. 11, 545–555 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hong, Y. et al. Regulación de HSF1 por modificación SUMO-1 inducida por estrés. J. Biol. química 276, 40263–40267 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kaur, J. & Khan, SA Análisis de campo eléctrico y tasa de absorción específica (SAR) en tejido de piel multicapa expuesto a frecuencias de comunicación móvil 5G. Conferencia AIP proc. 2142, 110028 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Percherancier, Y. et al. Papel de SUMO en la degradación de la proteína de leucemia promielocítica (PML) mediada por RNF4: sumoilación de PML y control de interruptor de fósforo de su dominio de unión SUMO disecado en células vivas. J. Biol. química 284, 16595–16608 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Komatsu, N. et al. Desarrollo de un backbone optimizado de biosensores FRET para quinasas y GTPasas. mol. Biol. Celda 22, 4647–4656 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Salón, MP et al. Reportero de luciferasa diseñado a partir de un camarón de aguas profundas que utiliza un sustrato novedoso de imidazopirazinona. ACS química. Biol. 7, 1848–1857 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shaner, NC y col. Una proteína fluorescente verde monomérica brillante derivada de Branchiostoma lanceolatum. Nat. Métodos 10, 407–409 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Takayama, K. et al. Defectos en el gen ERCC2 de reparación y transcripción del ADN en el grupo D de xeroderma pigmentoso, un trastorno propenso al cáncer. Cancer Res. 55, 5656–5663 (1995).

CAS PubMed Google Académico

Colombo, I. et al. Las células HaCaT como modelo fiable de diferenciación in vitro para diseccionar la respuesta inflamatoria/reparadora de los queratinocitos humanos. mediat. inflamacion 2017, 1–12 (2017).

Artículo Google Académico

Ruigrok, HJ et al. Multiplexación de espectro completo de transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia en tres canales TRPV. Biografía. J. 112, 87–98 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hamdan, FF, Percherancier, Y., Breton, B. & Bouvier, M. Supervisión de las interacciones proteína-proteína en células vivas mediante la transferencia de energía por resonancia bioluminiscente (BRET). actual Protocolo Neurosci. https://doi.org/10.1002/0471142301.ns0523s34 (2006).

Artículo PubMed Google Académico

Orlacchio, R. et al. Una novedosa cámara de reverberación para experimentos bioelectromagnéticos in vitro a 3,5 GHz. Trans. IEEE. electromagnético Compat. 65, 39–50 (2022).

Artículo Google Académico

Hill, D. Teoría electromagnética de las cámaras de reverberación (1998).

Leveque, P., Reineix, A. & Jecko, B. Modelado de pérdidas dieléctricas en antenas parche microstrip: Aplicación del método FDTD. Electrón. Letón. 28, 539–541 (1992).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Arts, R., Aper, SJA & Merkx, M. Proteínas de sensores BRET de ingeniería. En Métodos en Enzimología vol. 589 (eds. Arts, R. et al.) 87–114 (Elsevier, 2017).

Google Académico

Barna, J., Csermely, P. y Vellai, T. Funciones del factor de choque térmico 1 más allá de la respuesta al choque térmico. Celúla. mol. Ciencias de la vida 75, 2897–2916 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kraemer, KH et al. Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland 20014, EE. UU. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 72, 59–63 (1975).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mateo, A. et al. Activación y represión específicas del estrés de los factores de choque térmico 1 y 2. Mol. Celúla. Biol. 21, 7163–7171 (2001).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mochizuki, N. et al. Imágenes espacio-temporales de la activación de Ras y Rap1 inducida por el factor de crecimiento. Naturaleza 411, 1065–1068 (2001).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Hatzis, P., Kyrmizi, I. & Talianidis, I. La interrupción de la comunicación potenciador-promotor mediada por proteína quinasa activada por mitógenos inhibe la expresión del factor nuclear 4α de hepatocitos. mol. Celúla. Biol. 26, 7017–7029 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Flora, SJS Estrés oxidativo inducido por arsénico y su reversibilidad. Radico libre. Biol. Medicina. 51, 257–281 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Muller, S. La conjugación con el modificador relacionado con la ubiquitina SUMO-1 regula la partición de PML dentro del núcleo. EMBO J. 17, 61–70 (1998).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Szymanski, L., Cios, A., Lewicki, S., Szymanski, P. & Stankiewicz, W. Vía Fas/FasL y citoquinas en queratinocitos en dermatitis atópica - Manipulación por el campo electromagnético. PLoS One 13, e0205103 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Choi, J. et al. La exposición continua a campos electromagnéticos LTE de 1,7 GHz aumenta las especies de oxígeno reactivo intracelular para disminuir la proliferación de células humanas e inducir la senescencia. ciencia Rep. 10, 9238 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, S. et al. La inducción de daño en el ADN dependiente del tipo de célula por campos electromagnéticos de radiofrecuencia de 1800 MHz no da como resultado disfunciones celulares significativas. PLoS One 8, e54906 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bawin, SM & Adey, WR Sensibilidad de la unión del calcio en el tejido cerebral a campos eléctricos ambientales débiles que oscilan a baja frecuencia. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 73, 1999–2003 (1976).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Markov, MS "Ventanas biológicas": Un tributo a W. Ross Adey. Reinar. 25, 67–74 (2005).

Google Académico

Pooam, M. et al. La exposición al campo de radiofrecuencia de 1,8 GHz modula ROS en células HEK293 humanas en función de la amplitud de la señal. común Integrar Biol. 15, 54–66 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Agathokleous, E. & Calabrese, EJ Hormesis: Un principio biológico general. química Res. Toxicol. 35, 547–549 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Amirkavei, M. et al. El choque térmico hormético mejora la autofagia a través de HSF1 en las células del epitelio pigmentario de la retina. Celdas 11, 1778 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Calabrese, EJ Mecanismos horméticos. crítico Rev. Toxicol. 43, 580–606 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Calabrese, EJ Hormesis: Por qué es importante para la toxicología y los toxicólogos. Reinar. Toxicol. química 27, 1451 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sol, C. et al. La exposición a la señal del teléfono móvil desencadena un efecto similar a la hormesis en los fibroblastos embrionarios de ratón Atm+/+ y Atm–/–. ciencia Rep. 6, 37423 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Joushomme, A. et al. Estudio sin etiquetas del comportamiento celular global durante la exposición a campos de radiofrecuencia ambientales en presencia o ausencia de tratamientos proapoptóticos o proautofágicos. En t. J. Mol. ciencia 23, 658 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Agradecemos a Bernard Veyret por su sabio consejo y revisión del manuscrito.

La investigación que condujo a estos resultados recibió financiación de la Agencia Francesa de Alimentos, Medio Ambiente y Salud y Seguridad Ocupacional (ANSES) en virtud del acuerdo de subvención EST-19 RF-18 (el proyecto 5G-SAMU), y del consejo regional de Nueva Aquitania en virtud de la subvención acuerdo AAPR2020A- 2019-8140010 (El proyecto PHYSTRIG).

Universidad de Burdeos, CNRS, laboratorio IMS, UMR5218, F-33400, Talence, Francia

Alexandre Joushomme, Lorenza Patrignoni, Anne Canovi, Yann Loïck Chappe, Florence Poulletier De Gannes, Annabelle Hurtier, André Garenne, Isabelle Lagroye & Yann Percherancier

Universidad de Limoges, CNRS, XLIM, UMR 7252, F-87000, Limoges, Francia

Rosa Orlacchio, Philippe Lévêque y Delia Arnaud-Cormos

Institut Universitaire de France (IUF), F-75005, París, Francia

Delia Arnaud-Cormos

Universidad de Investigación de Ciencias y Letras de París, F-75006, París, Francia

isabel lagroye

Universidad de Burdeos, INSERM, Laboratorio BMGIC, UMR1035, F-33000, Burdeos, Francia

François Moisan y Muriel Cario

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

YP concibió y diseñó el estudio. PL, RO y DAC diseñaron el dispositivo del sistema de exposición y realizaron la dosimetría electromagnética. AJ, LP, AC, YLC, FPDG, AH, FM, MC y YP recopilaron y ensamblaron los datos. AG realizó el análisis estadístico de los resultados. YP, IL, DAC y PL escribieron el manuscrito. Todos los coautores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Yann Percherancier.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Joushomme, A., Orlacchio, R., Patrignoni, L. et al. Efectos de la exposición a campos de radiofrecuencia de 3,5 GHz modulados por 5G en la activación de HSF1, RAS, ERK y PML en fibroblastos vivos y células de queratinocitos. Informe científico 13, 8305 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35397-w

Descargar cita

Recibido: 27 de octubre de 2022

Aceptado: 17 de mayo de 2023

Publicado: 23 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35397-w

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.